Con trai của Mary và Darnley, James, chào đời ngày 19 tháng 6 năm 1566 tại Lâu đài Edinburgh. Ông được rửa tội với tên Charles James vào tháng 17 tháng 12 năm 1566 theo nghi thức Công giáo tại Lâu đài Stirling. Cha mẹ đỡ đầu của James gồm Charles IX của Pháp, Elizabeth I của Anh và Emmanuel Philibert, Công tước Savoy. Mary từ chối để cho Đức Tổng Giám mục của St Andrews, người mà cô gọi là "một linh mục có thẹo", nhổ vào miệng của trẻ, như sau đó đã đổi ý.

Sau sự ra đời của James khiến cho vấn đề kế vị suôn sẻ hơn; vào cuối năm 1566 và đầu năm 1567, Darnley và Mary đã gần gũi với nhau hơn và đã hòa giải, bà thường thấy đến thăm phòng của chồng. Darnley, tuy nhiên, bị nhiều người xa lánh nhưng vẫn có được nhiều người ủng hộ mình bởi vì hành vi thất thường của ông. Ông vẫn nhấn mạnh mong muốn được làm Đồng cai trị, đó vẫn còn là một nỗi thất vọng lớn trong hôn nhân của họ.